Zamość został założony przez kanclerza i hetmana wielkiego koronnego Jana Zamoyskiego 10 kwietnia 1580 r., a jego struktura organizacyjna wzorowana była na Lwowie. 12 czerwca tego samego roku król Stefan Batory potwierdził akt lokacji nadający prawa miejskie i herb z wizerunkiem św. Tomasza Apostola z włócznią. Król zezwolił na zakładanie cechów i wyznaczył trzy jarmarki w roku. Zamość miał być miastem-fortecą, siedzibą zatwierdzonej 9 lat później Ordynacji Zamojskiej. Początkowo przywilej lokacyjny przewidywał możliwość osiedlania się w mieście tylko katolików. Jan Zamoyski szybko doprowadził jednak do uchylenia tych ograniczeń. Od 1585 r. osiedlać się mogli także Ormianie, od 1588 r. Żydzi, a od 1589 r. Grecy. Niebawem w Zamościu mieszkali już przedstawiciele 12 narodowości, wśród nich nawet Szkoci, Anglicy, Holendrzy, Węgrzy, Persowie i Turcy.
Twórcą renesansowego planu miasta byt słynny włoski architekt Bernardo Morando. To jemu Zamość zawdzięcza późniejsze określenie „Padwa Północy”. Naczelne miejsce zajmowała rezydencja – pałac Zamoyskich. Przedłużeniem osi rezydencji była ul. Grodzka, stanowiąca główną drogę biegnącą przez środek miasta. Zabudowania pałacowe usytuowane wokół podłużnego dziedzińca koncentrowały życie dworu. Mieszczaństwo skupiało się wokół rynków: Wielkiego, Solnego i Wodnego. Po obu stronach pałacu ulokowane były Akademia Zamojska i kolegiata. Ratusz wzniesiono na Rynku Wielkim. Miasto otoczono nowoczesnymi fortyfikacjami bastionowymi (z siedmioma bastionami). Po licznych rozbudowach – trwających aż do 1866 r. – powierzchnia obwarowań przekroczyła dwukrotnie obszar samego miasta.
Akademia Zamojska została zatwierdzona bullą Klemensa VIII w 1594 r. Z aktu fundacyjnego akademii pochodzą znane słowa Jana Zamoyskiego: „Zawsze takie będą Rzeczypospolite, jakie ich młodzieży chowanie”. Wykładali tu Szymon Szymonowic, Adam Burski, Tomasz Birkowski, Tomasz Drezner. Uczelnia została zamknięta przez władze austriackie w 1784 r., obecnie mieści się w jej budynku liceum im. Jana Zamoyskiego.
W 1601 r. Jan Zamoyski utworzył „Bank pobożny”, służący pożyczkami ubogim. Kanclerz wielki koronny, twórca Ordynacji i założyciel Zamościa, zmarł w 1605 r. W następnych latach kończono budowę fortyfikacji, wzniesiono także cerkiew, kościół ormiański i synagogę. W 1637 r. nastąpiła konsekracja kolegiaty i fundacja kościoła franciszkanów. W kolegiacie odbywały się uroczystości przysięgi na wierność statutowi Ordynacji kolejnych ordynatów. Świątynia stała się także mauzoleum rodu Zamoyskich.
Miasto-twierdza przez lata pozostawało nie zdobyte. W 1648 r. skutecznie przetrzymało oblężenie Kozaków i Tatarów, w 1656 r. atak szwedzki. W 1649 i 1656 r. zatrzymał się tu król Jan Kazimierz. W 1699 r. miasto odwiedza król August II, a po nim car Piotr I. Zmodernizowane w końcu XVII w. fortyfikacje Zamościa, w początkach XVIII w. obroniły go podczas wojny północnej. W wyniku I rozbioru twierdza trafiła do zaboru austriackiego.
W 1780 r. miasto odwiedził cesarz austriacki Józef II. W 1809 r. Zamość został zdobyty przez ks. Józefa Poniatowskiego. Miasto staje się częścią Księstwa Warszawskiego, a od 1815 r. Królestwa Polskiego. W 1816 i 1818 r. wizytował je car Aleksander I. Jego inicjały zostały wyryte na frontonach Nowej Bramy Lwowskiej i Nowej Bramy Lubelskiej. W 1829 r. miasto wizytuje car Mikołaj I.
W 1821 r. Zamość przestał być prywatnym miastem Ordynacji – został upaństwowiony (Zamoyscy otrzymali w zamian dobra w Puszczy Kamienieckiej). W latach 1821-1831 fortyfikacje miejskie gruntownie przebudowano i dostosowano do ówczesnych wymogów obronnych. Podczas tych robót adaptowano na koszary, więzienia i magazyny wiele istotnych dla historii Zamościa budowli (pałac, gmach akademii, ratusz), kilka innych rozebrano (m.in. kościoły bazylianów, reformatów i ormiański). W połowie XIX w. nadbudowano staromiejskie kamieniczki, niszcząc ich renesansowe attyki. Podczas powstania listopadowego twierdza znalazła się w polskich rękach. Dowódcą był Jan Krysiński. 21 XI 1831 r. skapitulowała jako ostatnia w kraju. W 1865 roku, po powstaniu styczniowym, więziony był w niej ostatni dowódca powstańczy – ks. Stanisław Brzóska. Rok później twierdza przestała istnieć, a część fortyfikacji zburzono. Zamość od tej pory był miastem otwartym. Wśród dawnych umocnień zbudowano ogrody i zieleńce. Ich twórcą był Walerian Kronenberg.
W 1916 r., podczas budowy linii kolejowej Rejowiec – Bełżec, powstało także jej odgałęzienie do Zamościa. W 1917 r. przeprowadzono szlak do Hrubieszowa. W latach 1922-1935 w Zamościu mieszkał poeta Bolesław Leśmian, pobyt ten upamiętnia tablica pamiątkowa (ul. Żeromskiego 3). Podczas wojny obronnej 1939 r. pod Zamościem ciężkie bitwy z wrogiem toczyły armie „Lublin” i „Kraków” tworzące front środkowy, później armie frontu północnego. Po zajęciu przez Niemców, miasto stało się ważnym ośrodkiem germanizacyjnym. Jego nową nazwą miał być Himmlerstadt. Funkcjonowało tutaj getto żydowskie, obóz dla jeńców radzieckich (od 1941 r.), a w rotundzie utworzono obóz przejściowy, później obóz zagłady. Straciło w nim życie kilka tysięcy osób różnej narodowości. W 1947 r. Zamość został odznaczony Krzyżem Grunwaldu III klasy.
W latach 1975-1999 funkcjonowało województwo zamojskie, którego Zamość był stolicą. W 1992 r. starówka została wpisana na listę światowego dziedzictwa ludzkości UNESCO. W 1994 r. miasto znalazło się na ogłoszonej przez prezydenta RP liście 15 obiektów o szczególnym znaczeniu dla historii i kultury narodowej. W Zamościu działają szkoły wyższe. Podejmowane są też starania zmierzające do reaktywowania Akademii Zamojskiej.